关键词:
清酒乳杆菌
培养基配方
人工神经网络
高密度发酵
动力学模型
冻干保护剂
抗冻干能力
摘要:
发酵肉制品因其独特的风味、较长贮存期及益生菌优势,在全球市场占据重要地位。传统自然发酵受环境因素影响,导致发酵肉制品质量波动较大,难以满足现代工业生产需求。发酵剂是决定发酵肉制品品质与生产效率的关键。目前,国内工业生产普遍依赖进口发酵剂,国产菌剂仍存在活性不足、抗逆性弱等问题,亟需开发兼具高效增殖和优良发酵特性的直投式干粉发酵剂。菌种的高密度培养与冻干保护技术是直投式发酵剂开发的核心环节,但由于相关技术尚不成熟,成为制约国产发酵剂工业化生产的重要瓶颈。本实验室前期从传统云南腊肉中成功筛选获得一株清酒乳杆菌(Latilactobacillus sakei,***),该菌株不产气、不产硫化氢和过氧化氢,具备耐盐、耐酸、耐亚硝酸盐等特性,符合肉类发酵剂筛选标准,并在发酵香肠中表现出良好的风味提升效果,具有广阔的工业应用潜力。然而,该菌株在传统培养条件下难以实现高密度生长,限制了其在工业发酵剂中的应用。为解决上述问题,本研究以该优质菌株为出发点,围绕高密度培养与冻干存活两大核心技术,通过培养基质优化、发酵工艺参数优化、发酵罐高密度培养策略构建及复配冻干保护剂筛选与作用机制探究,得到高活力的清酒乳杆菌直投式发酵剂,为发酵肉制品行业提供可靠的理论和技术支持。具体研究内容和研究结果如下:
(1)清酒乳杆菌培养基质的筛选及优化。以MRS培养基为基础,对培养基营养物质成分(碳源、氮源、缓冲盐和生长因子)进行单因素优选试验,筛选出最优种类及最适浓度为海藻糖3%,酵母浸粉3.5%,缓冲盐(无水乙酸钠∶K2HPO4∶柠檬酸氢二铵=5∶2∶2)0.9%,L-半胱氨酸0.7%。在此基础上,对优选结果进行Box-Behnken响应面试验设计,并构建反向传播-人工神经网络(BP-ANN)模型。两者对比分析发现BP-ANN模型能更为精确的预测,基于此模型选定优化培养基质配方为海藻糖30.20g·L-1、酵母浸粉35.30g·L-1、无水乙酸钠5.72g·L-1、磷酸氢二钾2.29g·L-1、柠檬酸氢二铵2.29g·L-1、L-半胱氨酸8.00g·L-1,硫酸锰0.25g·L-1、硫酸镁0.50g·L-1、吐温-80 1.00g·L-1,在此条件下,清酒乳杆菌的最大活菌数达到9.11±0.0462(lg CFU/m L)。
(2)清酒乳杆菌的高密度发酵及动力学模型构建。以清酒乳杆菌为研究对象,通过锥形瓶试验初步筛选不同关键培养条件对清酒乳杆菌的活菌数和菌体密度的影响,确定最优基础培养条件为温度35℃、初始p H6.5、接种量3%、装液量60%。在锥形瓶小试的基础上,利用5L发酵罐对清酒乳杆菌进行扩大培养,对罐上培养关键工艺参数进行优化,确定清酒乳杆菌的最优发酵工艺参数为转速300rpm、通氧速率为0.2L·min-1、恒定p H5.2,中和剂为Na OH。通过对5L发酵罐高密度发酵过程中菌体活菌数、乳酸生成量和底物糖浓度的变化进行监测,并利用传统微生物动力学模型和NAR神经网络两种方法,构建清酒乳杆菌生长动力学、产物生成及底物消耗三种动力学模型,得到清酒乳杆菌发酵过程的动态变化规律以及菌体生长的主要抑制因素(因乳酸积累带来的酸抑制和底物不足造成的生长停滞)。为了解除发酵抑制,实现清酒乳杆菌的高密度培养,进行恒p H分批培养和恒p H恒流加补料两种发酵策略。结果表明,恒p H恒流加的反馈补料策略效果最佳,采用此策略培养后清酒乳杆菌活菌数可达10.38 lg CFU/m L,相比于恒p H分批培养(9.45 lg CFU/m L),提高了8.7倍;相比于罐上高密度培养前(9.12 lg CFU/m L),提高了18.3倍。
(3)清酒乳杆菌冻干保护剂的筛选及优化。以清酒乳杆菌为研究对象,探究真空冷冻干燥过程中不同冻干保护剂成分(蛋白类、糖类、氨基酸及其衍生物类、多元醇类、抗氧化类物质)对清酒乳杆菌的保护效果。以冻干存活率为指标,经过单因素试验筛选出最佳的保护剂种类和浓度为脱脂乳8%,海藻糖8%,谷氨酸钠0.6%,抗坏血酸0.2%。在此基础上,对优选结果进行Box-Behnken响应面试验设计并构建BP-ANN神经网络模型。两者对比分析发现BP-ANN模型能更为精确的预测,误差小且优化后清酒乳杆菌冻干存活率较高。因此,选定优化复配冻干保护剂最优配方为脱脂乳浓度7.83%,海藻糖浓度7.91%,谷氨酸钠浓度2.93%,抗坏血酸浓度4.32%,在此条件下,清酒乳杆菌的冻干存活率可达到93.58%±0.0125。对冻干菌粉的活菌数进行为期60天的检测,发现-20℃下储存能够维持较高的细胞活性,60天时活菌数为10.94±0.0037(lg CFU/g),菌粉有较好的贮藏稳定性。
(4)清酒乳杆菌复配冻干保护剂的作用机制探究。本研究以添加复配保护剂得到的冻干粉